Polimeraz zincir reaksiyonu
Polimeraz zincirleme tepkimesi (polymerase chain reaction - PCR), DNA içerisinde yer alan, dizisi bilinen iki segment arasındaki özgün bir bölgeyi enzimatik olarak çoğaltmak için uygulanan tepkimelere verilen ortak bir isimdir.
Metot basitçe tüp içerisinde nükleik asitlerin uygun koşullarda çoğaltılması esasına dayanır. Bir çeşit "in vitro klonlama" olarak da tanımlanan PCR; 94 °C-98 °C aralığında gerçekleştirilen denatürasyon, kullanılan başlatıcı diziye bağlı olarak 55 °C-72 °C aralığında gerçekleştirilen tavlama (İng. annealing)[1] ve 72 °C'de gerçekleştirilen sıcaklığa dirençli bir DNA polimeraz olan Taq polimerazın kullanıldığı[2] uzama aşamalarından oluşur ve bu döngülerin belirli sayıda tekrarlanmasına dayanır.[3] Dr. Kary B. Mullis 1980'li yıllarda yaptığı PCR çalışmaları ile 1993 yılında Kimya alanında Nobel Ödülü almıştır.[4]
PCR yaygın olarak tıbbi ve biyolojik araştırma laboratuvarlarında kalıtsal hastalıkların teşhisi, genetik parmak izlerinin tanımlanması, bulaşıcı hastalıkların teşhisi, genlerin klonlanması, babalık testi ve DNA hesaplaması gibi değişik konularda yaygın bir şekilde kullanılmaktadır.[3]
PCR yöntemine dayalı olarak birçok primer olarak adlandırılan başlatıcı DNA dizileri geliştirilmiştir. Bu başlatıcı DNA'lar belli dizilere sahip ve sentetik olarak üretilebilen moleküllerdir. Günümüzde başlatıcı diziler çoğaltılacak olan DNA dizisi için özellikle tasarlanır.[5] PCR'a dayalı ARMS, RAPD, AFLP, SSR ve ISSR gibi çeşitli moleküler teknikler geliştirilmiştir. Bu teknikler birçok bitki ve hayvanda genetik akrabalığın teşhisinde tür içi ve türler arasında kullanılmaktadır.
Aşamalar
[değiştir | kaynağı değiştir]PCR yöntemi, genellikle yaklaşık 30 denatürasyon-tavlama-uzama döngüsünden oluşmakla birlikte döngülerden önce yaklaşık 5 dakikalık bir denatürasyon süreci ve sonrasında yine yaklaşık 5 dakikalık bir uzama süreci içerir. Bu süreçler PCR'dan önce DNA zincirlerinin birbirinden ayrılmış olduğundan ve sonrasında zincirlerin tamamlandığından emin olunmasını sağlar.[6]
Denatürasyon
[değiştir | kaynağı değiştir]DNA dizisinin çoğaltılması için iki zincirin ayırılması gerekmektedir, bunun için de 20-30 saniye boyunca yaklaşık 95 °C sıcaklıklarına maruz bırakılması gerekmektedir.[6] Çoğu enzim bu sıcaklıklarda denatürasyona uğrayacağı için kullanılamaz. PCR yönteminin gelişmesinde en büyük katkıyı kullanılan yüksek sıcaklıklara dayanabilen Taq polimeraz enziminin bulunması yapmıştır. Bu enzim ilk olarak Yellowstone Millî Parkı'nda bir kaplıcada yaşayan Thermus aquaticus bakterisinden izole edilmiştir.[7]
Tavlama
[değiştir | kaynağı değiştir]Tavlama sıcaklığı genellikle başlatıcı dizilerin erime sıcaklığının, yani DNA zincirinden ayrıldığı sıcaklığın (Tm, İng. primer melting temperature) 5 °C altında olacak şekilde ayarlanır, böylece başlatıcı dizinin özel olarak hedef DNA zincirine bağlanıp diğerlerine bağlanmaması sağlanır.[8] Bu sıcaklık guanin ile sitozinin üçlü hidrojen bağı kurup adenin ile timinin ikili hidrojen bağı kurması nedeniyle başlatıcı dizideki AT/GC yüzdesine bağlıdır. Kısa diziler için Tm=2(A+T)+4(G+C) olarak hesaplanabilirken 13 nükleotitten uzun başlatıcı diziler için Tm=64,9+41(G+C-16,4)/(toplam nükleotit sayısı) olarak hesaplanabilir.[9] Tavlama aşaması yaklaşık 20-60 saniye sürer.[6]
Uzama
[değiştir | kaynağı değiştir]Uzama için Taq polimeraz enziminin en iyi çalıştığı sıcaklık olan 72 °C kullanılır.[10] Uzama süresi ise çoğaltılacak olan DNA zincirinin uzunluğuyla doğru orantılı olup bin baz çifti başına 10 saniye[11] ile 1 dakika[6] arasında değişir.
Çeşitler
[değiştir | kaynağı değiştir]Ters transkriptaz PCR (RT-PCR)
[değiştir | kaynağı değiştir]RT-PCR DNA yerine bir mRNA dizisinin çoğaltılmasını sağlamak için kullanılan PCR yöntemidir. Bu yöntemde ters transkriptaz (İng. reverse transcriptase, RT) enzimi mRNA dizisini cDNA (İng. complementary DNA, tamamlayıcı DNA) dizisine dönüştürmek için kullanılır ve cDNA üzerine PCR uygulanır.[12] Bir adımlı ve iki adımlı olarak ayrılır. Ters transkriptaz enzimi için başlatıcı dizi olarak duruma bağlı olacak şekilde rastgele heksamerler, oligo-d(T) dizileri ya da özel hazırlanmış diziler kullanılabilir.[13] Bir adımlı RT-PCR'da özel başlatıcı diziler kullanılmalıdır çünkü hem mRNA hem de cDNA dizilerine bağlanmaları gerekmektedir. Buna karşın, iki adımlı RT-PCR'da ters transkripsiyon ve PCR aşamaları ayrı başlatıcı diziler kullanılarak sırayla yapılır ve ters transkripsiyon adımı için üç çeşit başlatıcı diziden herhangi biri kullanılabilir.[14]
Nicel PCR (qPCR)
[değiştir | kaynağı değiştir]Nicel (ing. quantitative) ya da gerçek zamanlı PCR yöntemi temel PCR yönteminin aksine sadece DNA'nın varlığını değil miktarını da bulmayı amaçlayan PCR yöntemidir. Çoğaltılan DNA'nın miktarını hesaplamak için DNA dizisine özel floresan boyalar kullanılabilir.[15] RT-PCR ile beraber kullanıldığında qRT-PCR (İng. quantitative real-time PCR) olarak bilinir ve mRNA miktarını, dolayısıyla gen ifadesini ölçmek için kullanılır.[16]
Multipleks PCR
[değiştir | kaynağı değiştir]Multipleks PCR yönteminde birden fazla başlatıcı dizi çifti kullanılarak birden fazla dizi çoğaltılır. Tepkimenin istenen şekilde gerçekleşmesi için her dizi için dikkatli bir şekilde optimize edilmesi gerekir.[17]
Ayrıca bakınız
[değiştir | kaynağı değiştir]- Gen yalıtımı
- Gen çoğaltımı
- Gen kuvvetlendirilmesi
- Rekombinant DNA teknolojisi
- Amplifikasyon Dirençli Mutasyon Sistemi (ARMS)
Kaynakça
[değiştir | kaynağı değiştir]- ^ "Optimization of PCR Conditions for Amplification of GC‐Rich EGFR Promoter Sequence" (İngilizce). doi:10.1002/jcla.21632. PMC 6807403
. PMID 24218132.
- ^ Amils, Ricardo (2011), Gargaud, Muriel; Amils, Ricardo; Quintanilla, José Cernicharo; Cleaves, Henderson James; Irvine, William M.; Pinti, Daniele L.; Viso, Michel (Ed.), Taq Polymerase (İngilizce), Springer Berlin Heidelberg, ss. 1648-1648, doi:10.1007/978-3-642-11274-4_15618 Ocak 2025
- ^ a b "Polymerase Chain Reaction (PCR)". Genome.gov (İngilizce). 9 Temmuz 2019 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 13 Nisan 2023.
- ^ "The Nobel Prize in Chemistry 1993". NobelPrize.org (İngilizce). 5 Aralık 2018 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 13 Nisan 2023.
- ^ "PCR primer design". www.qiagen.com (İngilizce). 12 Ağustos 2024 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 8 Ocak 2025.
- ^ a b c d Baumforth, K. R.; Nelson, P. N.; Digby, J. E.; O'Neil, J. D.; Murray, P. G. (1 Şubat 1999). "Demystified ... the polymerase chain reaction". Molecular Pathology (İngilizce). 52 (1): 1-10. doi:10.1136/mp.52.1.1. ISSN 1366-8714. PMC 395663 . PMID 10439832.
- ^ Briggs, George M. (2021). "Thermus aquaticus" (İngilizce). 18 Nisan 2022 tarihinde kaynağından arşivlendi13 Nisan 2023.
- ^ Evans, Zoe; Lubelsky, Yoav (3 Nisan 2018). "WHY does increasing the annealing temperature make PCR more specific?" (İngilizce). Erişim tarihi: 8 Ocak 2025.
- ^ "Melting Temperature (Tm) Calculation". insilico.ehu.es (İngilizce). 15 Nisan 2024 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 8 Ocak 2025.
- ^ Caetano-Anollés, D. (1 Ocak 2013), Maloy, Stanley; Hughes, Kelly (Ed.), Polymerase Chain Reaction, Academic Press, ss. 392-395, doi:10.1016/b978-0-12-374984-0.01186-4, 20 Eylül 2024 tarihinde kaynağından arşivlendi8 Ocak 2025
- ^ "PCR Optimization (E0555) | NEB". www.neb.com. 12 Eylül 2024 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 8 Ocak 2025.
- ^ Bachman, Julia (1 Ocak 2013), Lorsch, Jon (Ed.), Chapter Two - Reverse-Transcription PCR (RT-PCR), Laboratory Methods in Enzymology: RNA (İngilizce), Academic Press, ss. 67-74, doi:10.1016/b978-0-12-420037-1.00002-6, 11 Eylül 2024 tarihinde kaynağından arşivlendi9 Şubat 2025
- ^ "What are the common reverse transcription primers? | AAT Bioquest". www.aatbio.com (İngilizce). 8 Mart 2024 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 9 Şubat 2025.
- ^ "Reverse Transcription PCR (RT-PCR) | AAT Bioquest". www.aatbio.com (İngilizce). 11 Aralık 2024 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 9 Şubat 2025.
- ^ Dymond, Jessica S. (2013), Lorsch, Jon (Ed.), Chapter Twenty Three - Explanatory Chapter: Quantitative PCR, Laboratory Methods in Enzymology: DNA (İngilizce), Academic Press, ss. 279-289, doi:10.1016/b978-0-12-418687-3.00023-9, 23 Nisan 2024 tarihinde kaynağından arşivlendi9 Şubat 2025
- ^ Jozefczuk, J.; Adjaye, James (2011), Jameson, Daniel; Verma, Malkhey; Westerhoff, Hans V. (Ed.), Chapter Six - Quantitative Real-Time PCR-Based Analysis of Gene Expression, Methods in Systems Biology (İngilizce), Academic Press, ss. 99-109, doi:10.1016/b978-0-12-385118-5.00006-2, 12 Temmuz 2024 tarihinde kaynağından arşivlendi9 Şubat 2025
- ^ Davidson, Irit (Aralık 2019). "Biotic concerns in generating molecular diagnosis matrixes for 4 avian viruses with emphasis on Marek's disease virus". Journal of Virological Methods (İngilizce). 274: 113708. doi:10.1016/j.jviromet.2019.113708. ISSN 0166-0934. PMC 7119753 . PMID 31351169. 27 Temmuz 2024 tarihinde kaynağından arşivlendi9 Şubat 2025.
